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      光遺傳

      光遺傳學(optogenetics)是一項整合了光學、軟件控制、基因操作技術、電生理等多學科交叉的技術,其主要原理是首先采用基因操作技術將光感基因(如ChR2,eBR,NaHR3.0,Arch或OptoXR等)轉入到神經系統中特定類型的細胞中進行特殊離子通道或GPCR的表達。光感離子通道在不同波長的光照刺激下會分別對陽離子或者陰離子的通過產生選擇性,如Cl-、Na+、H+、K+,從而造成細胞膜兩邊的膜電位發生變化,達到對細胞選擇性地興奮或者抑制的目的。2010年光遺傳學被《Nature Methods》雜志評選為“最受關注科技成果技術”之一,這項技術可應用多種神經紊亂類疾病的治療,如癲癇、帕金森癥、慢性疼痛癥、抑郁癥、成癮癥等。

      基本原理

      光敏感蛋白根據功能分為激活神經元的光敏感蛋白、抑制神經元的光敏感蛋白和控制體內G蛋白偶聯信號的光敏感蛋白。典型的用于激活神經元的光敏感通道蛋白為ChR2(channelrhodopsin),ChR2是一種離子通道蛋白,在藍光(最大激發峰在470nm 波長附近)的激發下會誘導陽離子通道的打開,促使神經元的去極化,進而誘發動作電位,激活神經元。典型的抑制神經元活動的光敏感蛋白為NpHR(鹽系菌視紫紅質),該蛋白在黃綠光(最大激發峰在590nm 波長附近)的激發下會誘導氯離子通道的打開,氯離子內流造成神經元的超極化,從而抑制神經元動作電位的產生。除此之外,還有在蘇打鹽紅菌里發現的Arch(古紫質),該蛋白在黃綠光(最大激發峰在566nm 波長附近)的激發下會誘導質子的外流,從而產生超極化信號,抑制神經元的活動。

      優勢


      光遺傳 化學遺傳
      分辨率 高時空分辨率,在神經元調控上其可達到亞毫秒
      和毫秒級,空間精度可達單個細胞級別。且光停止
      瞬間,幾乎就可以停止光刺激帶來的效應
      分鐘級,且CNO作用在神經元上之后
      一般需2小時才能從膜上清除
      實驗操作 操作要求高,需要埋入光纖、
      操作激光控制器和導管等配件
      操作簡單,僅腹腔注射或喂食給藥即可
      與光遺傳相比,無需開顱手術埋置光纖
      是否可長期
      操作神經元
      由于激光產熱等機械限制,
      長時間處理神經元幾乎不可能實現
      持續給藥是可行的
      適合長期神經元環路調節研究

      光遺傳常用病毒工具

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      貨號 載體名稱 啟動子 啟動子表達位置 主要元件 螢光 表達方式
      AAV00101 pAAV-CaMKlla-DIO-hM4D(Gi)-eGFP CaMKlla 谷氨酸能神經元 DIO-hM4D(GI) EGFP Cre誘導表達
      AAV00085 pAAV-EF1a-DIO-hM3D(Gq)-mCherry EF1a 廣譜 DIO-hM3D(Gq) mCherry Cre誘導表達
      AAV00087 pAAV-EF1a-DIO-hM4D(Gi)-mCherry EF1a 廣譜 hM4D(Gi) mCherry 正常表達
      AAV00090 PAAV-GFAP-hM3D(Gq)-mcherry GFAP 星形膠質細胞
      神經干細胞
      hM3D(Gq) mCherry 正常表達
      AAV00088 ; PAAV-GFAP-hM4D(Gi)-mcherry GFAP 星形膠質細胞
      神經干細胞
      hM4D(GI) mCherry 正常表達
      AAV00030 pAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry hSyn 神經元 DIO-hM3D(Gq) mCherry Cre誘導表達
      AAV00071 pAAV-hSyn-DI0-hM3D(Gq)-eGFP hSyn 神經元 DIO-hM3D(Gq) EGFP Cre誘導表達
      AAV00031 pAAV-hSyn-DlO-hM4D(Gi)-mCherry hSyn 神經元 DIO-hM4D(Gi) mCherry Cre誘導表達
      AAV00099 pAAV-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-EGFP hSyn 神經元 DIO-hM4D(Gi) EGFP Cre誘導表達
      AAV00096 pAAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRES-mCitrine hSyn 神經元 hM3D(Gq) mCitrine 正常表達
      AAV00093 pAAV-hSyn-HA-hM4D(GI)-IRES-mCtrine hSyn 神經元 hM4D(GI) mCitrine 正常表達
      AAV00100 pAAV-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry hSyn 神經元 hM4D(GI) mCherry 正常表達


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      如何使用光遺傳學病毒工具進行研究

      Step1:尋找合適的光敏蛋白

      光敏蛋白可分為激活型和抑制型兩種,能夠引起神經元興奮或抑制。其光靈敏度和動力學之間存在負相關,激活或抑制能力強弱與時間的精準控制密切相關,所以,根據光敏感蛋白的不同特性尋找合適的光敏感蛋白是首要步驟。


      Step2:向靶細胞內導入光敏蛋白基因

      利用轉染、病毒注射或轉基因動物等方法將編碼光敏感蛋白的基因輸入到靶細胞中,其中,病毒注射是光遺傳學研究的主導手段,主要采用慢病毒和腺相關病毒。


      Step3:對光信號進行時空調控

      可采用導入光纖或控制激光的方式將光導入研究區域,選擇不同的參數(波長、光強度、頻率和占空比)進行光刺激,來達到對神經元活動的時間調控;通過選擇性地照射細胞局部的方法來實現對神經元活動的空間調控。


      Step4:收集輸出信號,讀取結果

      一般采用電極記錄神經元細胞膜內外的電壓變化,并可用熒光性生物傳感器來檢測不同細胞數值,通過電生理記錄或行為學測試等方法,將光刺激對神經元、神經回路或動物行為的改變呈現出來。

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