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      基因操作工具制備

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      神經注射

      神經科學是近年來快速發展的前沿學科,以病毒載體為介導的機制研究、基因治療及神經環路是神經研究的熱點。

      常用細胞模型

      疾病模型 造模方法 參考文獻
      阿爾茨海默病模型 20μmol/L的Aβ25-35加入海馬原代細胞孵育24h 1
      帕金森病模型 10μmol/L的MPP+加入中腦細胞孵育48h 2
      興奮性谷氨酸損傷模型 100μmol/L的谷氨酸鹽作用于皮質原代細胞5min 3


      參考文獻

      1. MP Mattson, Y Goodman, H Luo, et al. Activation of NF-kappa B protects hippocampal neurons against oxidative stress-induced apoptosis: evidence for induction of manganese superoxide dismutase and suppression of peroxynitrite production and protein tyrosine nitration. J Neurosci Res, 1997, 49(6): 681-697.

      2. X Cai, H Jia, Z Liu, et al. Polyhydroxylated fullerene derivative C60(OH)24 prevents mitochondrial dysfunction and oxidative damage in an MPP+-induced cellular model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience Research, 2008 , 86(16): 3622.

      3. SL Budd, DG Nicholls. Mitochondria, calcium regulation, and acute glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells. Journal of Neurochemistry, 1996, 67(6): 2282-2291.

      工具病毒選擇指南

      作為神經系統研究的關鍵工具,病毒載體具有感染效率高、操作方便等優勢,比較常用的病毒載體包括腺相關病毒、慢病毒、腺病毒等,如何根據自己的實驗需求選擇合適的病毒載體呢?


      1.  慢病毒:慢病毒對原代神經元細胞感染效率高、毒性低、損傷小,在感染后 2-4 天開始表達,并且可以長時間穩定表達外源基因,因此原代神經元細胞感染,通常首選慢病毒。在體注射時,慢病毒的優點是可以將靶基因整合入宿主的基因組中持續穩定的表達,且引起來的免疫反應溫和,可用于定點注射。
      2.  腺病毒:神經領域的研究較少使用腺病毒載體進行,因其易引起較強烈的免疫反應,嚴重時可導致實驗動物死亡。
      3.  腺相關病毒(AAV):與慢病毒相比,AAV體積小,滴度高,擴散性好,且具有更強的嗜神經特性。運用AAV載體的另一個顯著優點是有些AAV血清型,如PHP.eB,可穿過血腦屏障、胎盤屏障,可通過尾靜脈注射使用。此外AAV1,AAV Retro等血清型還可用于神經環路標記。




      了解了這些病毒載體在神經系統應用中的優勢和不足后,如何根據具體的實驗需求和基因情況選擇合適的病毒載體呢?我們需要考慮這幾個方面:

      1. 工具載體的表達時間與實驗觀察時間是否相符;

      2. 工具載體可以容納的片段大小與目的基因大小是否契合;

      3. 工具載體對目的細胞、在體組織的轉導是否足夠高效。


      下表總結了常用基因操作工具的選擇方法:

      病毒表達系統 慢病毒 腺病毒 腺相關病毒
      外源基因表達時間 2-4天開始表達長時間穩定表達 1-2天開始表達持續7-14天 7-14開始表達
      細胞分裂不旺盛部位可長時間表達
      插入片段大小 <4kb <5-8kb <2.8kb (包括必須的啟動子
      以及熒光或者標簽元件)
      穩定細胞株篩選 可以,外源基因整合于
      宿主基因組,篩選簡單
      不可以,瞬時表達外
      源基因傳代后效果減弱
      不可以
      細胞實驗 首選,廣譜,感染效率高 廣譜,感染效率高,
      適合原代非增殖細胞感染
      不適合細胞實驗
      動物實驗 適合,根據觀察時間和注射部位選擇 較適合(免疫原性高),根
      據觀察時間和注射部位選擇
      首選,根據觀察時間和注射部位選擇
      滴度 最高可達109TU/ml 高達1012pfu/ml 高達1012-13v.g/ml




      吉凱小建議

      1.  在體實驗建議選擇腺相關病毒,它具有滴度高,擴散效果好,免疫原性低等特點。且AAV 1/2/5/8/9/retro/ PHP.eB/ PHP.S 等血清型對神經系統均具有較好的親和性,如1型可作為順行示蹤跨單突觸標記的血清型使用 、9型可作為順行示蹤非跨突觸標記的血清型使用、Retro可作為逆向示蹤非跨突觸標記的血清型使用。 PHP.eB,適合中樞神經系統,可穿過血腦屏障、胎盤屏障,常通過尾靜脈注射使用;PHP.S,適合周圍神經系統,可穿過血腦屏障、胎盤屏障,常通過尾靜脈注射使用。


      1 2 5 6 8 9 DJ PHP.eB PHP.S Retro
      心臟






      肝臟












      胰腺






      骨骼肌




      神經

      眼部





      2.  原代神經元體外感染建議選擇慢病毒:慢病毒在感染原代神經元后2-4 天開始表達,且對神經元細胞的毒性低、損傷小。

      3.  如需目的基因在某一類神經元或膠質細胞中特異性表達,可使用特異性啟動子。吉凱提供組織特異性啟動子載體的病毒包裝服務,點擊了解>>

      組織 啟動子名稱 啟動子特性
      神經 hSyn 神經元特異性啟動子
      mecp2 較短的神經元特異性啟動子
      TUBA1A 早期神經元特異性啟動子
      c-fos 興奮神經元啟動子
      CaMKlla 前腦谷氨酸能神經元特異性啟動子
      hAGAT GABA能神經元/中間神經元特異性啟動子
      Slc6a3 多巴胺神經元特異性表達啟動子
      gfaABC1D 星形膠質細胞特異性啟動子
      lba1 小膠質細胞特異性啟動子
      CNP 少突膠質細胞或施萬細胞特異性表達啟動子

      注射方法

      在神經科學的研究方法中,為了使各種處理手段(給藥、毀損、病毒注射等)或信號采集(微電極、探針)到達目的腦區的相應位置,需要使用腦立體定位技術。下面以小鼠為例做詳細介紹:


      第一部分:實驗前準備

      準備內容:腦立體定位儀,常規手術器械,顱骨鉆,微量注射器,干棉球,1% 的戊巴比妥鈉,生理鹽水,1ml 注射器,小鼠。

      1. 首先,用1% 的戊巴比妥鈉,以腹腔注射的方式麻醉小鼠,注射量為80mg/kg 小鼠。

      2. 然后,從飼養籠中取出小鼠。

      3. 5-10min 后,麻醉劑起效。

      4. 待小鼠麻醉后,用剃毛器將小鼠頭部毛發剔除干凈。




      第二部分:固定小鼠

      1. 將麻醉剔毛后的小鼠固定到立體定位儀上。

      2. 固定時,先將小鼠門齒卡在適配器門齒夾上,輕輕壓上門齒夾橫桿,調整適配器高度和前后,使耳桿可以方便進入小鼠外耳道。

      3. 左手托起小鼠頭部,將左側耳桿插入小鼠耳道,調節左右側耳桿使動物頭部保持在U 型開口的中心位置,先鎖緊固定一側耳桿,后旋緊另一側耳桿,使動物頭部不能晃動,同時旋緊門齒夾螺絲。

      4. 檢查是否固定成功:鼻對正中,頭部不動,提尾不掉,目測大腦放置水平。

      5. 用脫毛膏或者剃刀將需要手術部位的毛發去除。

      6. 然后用手術刀劃開小鼠頭部皮膚,去除顱骨表面結締組織,暴露前后囟

      7. 根據腦圖譜,確定待注射腦區的位置參數,包含離Bregma Lambda點的距離以及核團深度。

      8. 以Bregma 0 點,按照預先確定好的坐標移動顱骨鉆,打開合適大小的骨窗(窗口盡量小但是又不妨礙實驗)。小心地用顱骨鉆在注射位點處輕磨顱骨,將顱骨慢慢打薄,當顱骨出現裂縫的時候,用醫用注射器的針頭小心挑破,防止損傷,如果在此過程中有出血,可以用很小的醫藥棉球拉成長條形將血吸走,鉆孔時一定要控制好,否則很容易在鉆通顱骨后一不小心鉆頭進入腦組織,造成損傷。




      第三部分: 注射病毒

      1. 用PBS 沖洗微量注射器(5μl 規格)3-5 次。

      2. 先吸取1μl 空氣,再吸取1μl 稀釋好的病毒( 方便病毒充分注射進腦),

      在空氣中測試注射器是否通暢;

      3. 將微量注射泵,微量注射器組裝好,置于鉆好的孔上方,針尖與顱骨平行(Z=0),微調注射器位置使之與之前鉆孔時位置相同。

      4. 根據定好的深度將注射針緩慢下降





      吉凱小建議:

      a. 注射病毒前,為確定核團定位是否正確,建議您使用神經順行示蹤的DiI染料于注射后1周,神經逆行示蹤的熒光金(Flouro gold)染料于注射后2周切片,并對照圖譜確認注射的核團位點無誤,再進行病毒注射,可有效提高病毒標記的成功率。

      b. 注意小鼠的狀態:由于俯臥體位以及腦立體定位儀的夾持,容易造成小鼠窒息死亡,因此需要隨時確認小鼠氣道通暢。另外,對于手術切開的部位,應適當滴加生理鹽水,防止傷口干燥。

      c. 大鼠顱骨水平位定位操作:定位時將大鼠固定成顱骨水平位后,先定位到前囟,以前囟為原點,向前或向后、向左或向右、向下(先在顱骨上打孔)到達核團位置,需要強調的是,坐標是以前囟為原點,而不是以鉆孔后的腦表面為原點。

      d. 冰凍切片時注意,先從所要核團外開始切(還不到核團所在層面),拿到的切片對照圖譜中的一些參照物來判斷核團是否準確(對照物可選大而清晰的海馬、視交叉,腦室、核團附近的特殊結構如纖維索等等),切片同時注意調節凍臺角度,使切片角度與圖譜一致。


      更多病毒注射操作視頻,點擊查看>>

      用量參考

      神經系統病毒用量參考
      以下表格中為吉凱客戶應用文獻總結(部分)。更多神經系統病毒注射參數,點擊查看與下載>>


      1. 腺相關病毒AAV

      注射
      物種
      注射
      部位
      AAV
      類型
      基因名稱 血清型 注射
      參數
      檢測
      時間
      文獻名
      大鼠 基底外側
      杏仁核BLA
      過表達 DHHC12 DHHC12 1ul/位點 4周 Gephyrin Palmitoylation in Basolateral Amygdala Mediates the Anxiolytic Action ofBenzodiazepine. Biological Psychiatry
      小鼠 腹側海馬 干擾和過表達 SIK2
      CRTC1
      CREB
      BDNF
      TrkB
      AAV2/8 雙側注射,注射速
      率:0.2μl/min(1μl/side),
      注射后停留4min。
      4周 Hippocampal Salt-Inducible Kinase 2 Plays a Role in Depression Via the CREB-Regulated Transcription Co-activator 1-Cyclic AMP Response Element Binding- Brain-Derived Neu-rotrophic Factor Pathway. Biological Psychiatry
      小鼠 雙側CA1 過表達 caspase- 1 AAV1 1μl/位點,
      共2μl。注射速率:
      0.2μl/min。
      停留時間: 10min
      14天 Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase- 1 confers resil-ience to chronic social defeat stress via regulatingthe stability of surface AMPARs. Molecular Psychiatry
      小鼠 海馬 干擾 LH3
      雙側注射。
      1μl/側。注射速率:
      0.2μl/min。 注射5min。
      保留時間: 5min

      Hippocampal PPARα is a novel ther-apeutic target for depression and apeutic target for depression and mediates the antidepressant of fluoxetine in mice. British journal of actions pharmacology.
      小鼠
      干擾 PPARa AAV9 滴度: 3 x 1012
      viral particles/ml

      Overexpression of LH3 reduces the incidence of hypertensive intracere-bral hemorrhage in mice. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM
      大鼠 右背側和
      腹側海馬
      干擾和過表達 LncRNA H19 AAV9 3μl/位點,共6ul。
      注射速率: 0.2μl/min
      14天 Long non-coding RNA H19 contrib-utes to apoptosis of hippocampal neurons byinhibiting let-7b in a rat model of temporal lobe epilepsy. Cell Death and Disease
      大鼠 周圍缺血
      皮質和同側
      紋狀體后部
      過表達 NT-1
      注射總量: 1 x 1010
      genome copies。注射速率: 0.2μl//min。
      保留時間: 15min
      3,14天 Netrin-1 Promotes Synaptic Forma-tion and Axonal Regeneration@via JNK 1/c- Jun Pathway after the8Middle Cerebral Artery Occlusion. Frontiers in Cellular Neuroscience


      代表文獻 吉凱客戶文章Molecular Psychiatry,(2017)00,1-13



      代表文獻 吉凱客戶文章Neuropharmacology, 128(2018) 207-220.




      2. 慢病毒

      注射
      物種
      注射
      部位
      注射
      體積
      病毒
      滴度
      注射
      總量
      注射速度
      及保留時間
      檢測時間 文獻名
      小鼠 皮質 3個位點,
      0.7μl/位點
      2E+9 TU/mL 1.4x106T
      U/位點,注射
      病毒總量4.2x106 TU
      注射速率0.2μl/min,
      針頭停留10min。
      5天 Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interac-tion of nNOS with PSD-95[J]. Nature medicine, 2010
      小鼠 S1 barrel field 0.5μl 干擾滴度
      1E+9 TU/mL
      5x105TU 注射速率0.2μl/min
      Oxytocin mediates early experi-ence -dependent cross -modal plas-ticity in the sensory cortices[J]. Nature neuroscience, 2014.
      大鼠 對側前邊緣皮質




      Deactivation of excitatory neurons in the prelimbic cortex via Cdk5 pro-motes pain sensation and anxiety.[J] .Nat Commun, 2015
      大鼠 下橄欖體 1μl 1E+8 TU/mL-1E+9 TU/mL 1x 105 TU-1x 106 TU 注射速率0.2μl/min,
      針頭停留5min。
      21天 Oxytocin mediates early experi-ence- - dependent cross- -modal plas-ticity in the sensory cortices[J]. Nature neuroscience, 2014.
      大鼠 右丘腦 4個位點,3μl/位點 4E+9 TU/ml 1.2E+7TU/位點
      2周 Beclin 1 knockdown inhibits auto-phagic activation and prevents the secondary neurodegenerative damage in the ipsilateral thalamus following focal cerebral infarction[J.Autophagy
      大鼠 海馬體CA1 5μl 1.5E+9TU/mL 7.5x106TU 注射速率0.3μl/min 14天 Neuroprotection of hypoxic postcon-ditioning against global cerebral isch-emia through influencing posttransla-tional regulations of heat shock pro-tein 27 in adult rats[J]. Brain Patholo-gy, 2017.
      大鼠 海馬體 5μl 2E+9 TU/mL 1x107TU 注射速率0.2μl/min,
      針頭保留5min
      7天 Association of mitochondrial letm1 with epileptic seizures[J]. Cerebral Cortex, 2013
      大鼠 背側紋狀體 雙側
      1E+8 lentiviral particles
      5天 Protein kinase D1-dependent phos-phorylation of dopamine D1 receptor regulates cocaine -induced behavioral responses[J]. Neuropsychopharma-cology, 2014
      小鼠 海馬齒狀回 雙側.2μl 2E+7 TU/mL-5E+8 TU/mL 4E+4Tu-1E+6Tu
      注射速率0.5μl/min,
      針頭保留5min
      14天 CNTNAP4 Impacts Epilepsy Through GABAA Receptors Regulation: Evi-dence From Temporal Lobe Epilepsy Patients and Mouse Models.[U]. Cereb. Cortex, 2018
      大鼠 小腦間位核 0.3μl 干擾滴度8E+8TU/mL
      過表達2E+8TU/mL

      注射3min,
      針頭保留5min
      7天 Modulation of immune function by glutamatergic neurons in the cerebel-lar interposed nucleus via hypotha-lamic and sympathetic pathways[J].
      Brain, behavior, and immunity, 2014


      代表文獻 吉凱客戶文章 Naturen medicine,2010,16(12):1439-1443





      3. 腺病毒

      注射
      物種
      注射
      部位
      注射
      體積
      病毒
      滴度
      注射速度
      及保留時間
      注射
      儀器
      檢測時間 文獻名
      小鼠 右腦室 3μl 1.3E+10pfu/ml 注射速度0.2μl/min 5μl
      微量注射器

      The long non-coding RNA Neat1 is an important mediator of the therapeutic effect of bexarotene on traumatic brain injury in mice[J]. Brain, Behavior, and Immunity, 2017.
      大鼠 左側腦室
      1.3E+10pfu/ml
      25號針頭
      PPAR β/δ, a Novel Regulator for Vascular Smooth Muscle CellsPhenotypic Modulation and Vas-cular Remodeling after Sub-arachnoid Hemorrthage in Rats[J]. Scientific Reports, 2017.
      大鼠 背側海馬體 10μl



      Notch1 Signaling Activation Con-tributes to Adult Hippocampal Neurogenesis Following Trau-matic Brain Injury[J]. Medical science monitor: international medical journal of experimental and clinical research, 2017.
      大鼠 腦室 10μl 過表達腺病毒6x1010pfu/mL,
      對照2x1010pfu/mL
      使用時用EN.S.
      稀釋為1.3x 1010pfu/mL
      注射后保留10min 25號針頭 7天 Peroxisome Proliferator - Activat-ed Receptor β/δ Alleviates Early Brain Injury After Subarachnoid Hemorrhage in Rats. Stroke
      大鼠 腦室 10μl 過表達腺病毒6x 1010pfu/mL,
      對照2x1010pfu/mL
      使用時用EN.S.
      稀釋為1.3x1010pfu/mL
      注射速度0.5μl/min,
      注射后保留10min
      26號針頭
      Endogenous hydrogen sulphide attenuates NL RP3 inflam-masome-mediated neuroinflam-mation by suppressing the P2X7 receptor after intracerebral hae-morrhage in rats[J. Journal of neuroinflammation, 2017.


      代表文獻 吉凱客戶文章 Brain,Behavior,and lmmunity,2017

      引用文獻

      1. Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95[J]. 2010, Nature medicine (IF= 32.621). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:腦缺血  南京醫科大學

      2. Oxytocin mediates early experience-dependent cross-modal plasticity in the sensory cortices[J]. 2014, Nature neuroscience (IF= 19.912). 吉凱產品:慢病毒  研究領域:神經  中科院神經科學研究所

      3. A Critical Role of Presynaptic Cadherin/Catenin/p140Cap Complexes in Stabilizing Spines and Functional Synapses in the Neocortex. 2017, Neuron (IF=14.024). 吉凱產品:RNAi慢病毒  研究領域:神經    中國科學院神經科學研究所

      4. Gephyrin Palmitoylation in Basolateral Amygdala Mediates the Anxiolytic Action of Benzodiazepine. Biological Psychiatry (IF= 11.982). 吉凱產品:過表達AAV  研究領域:焦慮癥  華中科技大學同濟醫學院

      5. Gene deficiency and pharmacological inhibition of caspase-1 confers resilience to chronic social defeat stress via regulating the stability of surface AMPARs. Molecular Psychiatry (IF= 11.64). 吉凱產品:過表達AAV  血清型:AAV1  研究領域:抑郁癥  華中科技大學同濟醫學院

      6. Hippocampal PPARα is a novel therapeutic target for depression and mediates the antidepressant actions of fluoxetine in mice. British journal of pharmacology (IF= 6.81). 吉凱產品:干擾AAV  研究領域:抑郁癥  南通大學藥學院

      7. Overexpression of LH3 reduces the incidence of hypertensive intracerebral hemorrhage in mice. JOURNAL OF CEREBRAL BLOOD FLOW AND METABOLISM (IF=6.045). 吉凱產品:干擾AAV  血清型:AAV9  研究領域:高血壓性腦出血  中國醫學科學院阜外醫院

      8. Melatonin-mediated inhibition of Cav3.2 T-type Ca2+ channels induces sensory neuronal hypoexcitability through the novel protein kinase C-eta isoform. 2018, Journal of Pineal Research (IF= 11.613). 吉凱產品:干擾腺病毒  研究領域:神經  蘇州大學

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