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      基因操作工具制備

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      慢病毒

      慢病毒(Lentivirus)是逆轉錄病毒的一種,基因組為單鏈RNA。但區別于一般的逆轉錄病毒,慢病毒具有更廣的宿主范圍,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。重組慢病毒載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I 型病毒)為基礎,使用皰疹病毒VSVG 外殼蛋白發展起來的工具載體,其毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代,屬于假型病毒。慢病毒可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。


      慢病毒可有效地感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞,為神經領域、心血管領域、肝臟、肌肉、、、腫瘤及其他領域的科研工作者們提供更強有力的基因研究工具。

      優勢

      慢病毒與其他病毒工具比較,具有以下優勢:

      a. 表達時間長:慢病毒通過將外源基因整合到宿主細胞基因組上,可實現目的基因長時間穩定的表達,不隨著細胞分裂傳代而丟失,是細胞實驗的首選;
      b. 安全性高:未發現致病性,已被用于CAR-T 治療作用于人體;
      c. 免疫原性低: 直接注射活體組織不易造成免疫反應,適用于動物實驗。

      病毒表達系統 腺病毒
      (Adenovirus)
      慢病毒
      (Lentivirus)
      腺相關病毒
      (Adeno-As sociate virus)
      病毒基因組 雙鏈DNA病毒 RNA病毒 單鏈DNA病毒
      復制 條件復制 不可復制 條件復制
      滴度 最高可達1012pfu/ml 最高可達109TU/ml 最高可達1012-13v.g/ml
      感染細胞類型 感染分裂和不分裂細胞 感染分裂和不分裂細胞 感染分裂不旺盛的細胞
      表達豐度 高水平表達 中到高水平表達 高水平表達
      表達時間 快(1-2天) 慢(2-4天) 1-2周
      持續表達時間 病毒基因組游離于宿主基因組外,
      瞬時表達外源基因
      病毒基因組整合于宿主基因組,
      長時間、穩定表達外源基因
      病毒基因組游離于宿主基因組外,
      在分裂旺盛的細胞中可長時間表達
      克隆容量 適合表達小于5kb的外源片段 適合表達小于4kb的外源片段 適合表達小于2.8kb的外源片段
      免疫原性 較高免疫原性 低免疫原性 低免疫原性
      安全性 可能會引起一些咳嗽流涕 暫無發現致病性,
      已被用于CAR-T治療作用于人體
      暫無發現致病性,
      已通過歐盟和FDA許可,
      用作基因治療藥物的載體

      包裝服務


      純化工藝

      吉凱獨有的病毒分級純化工藝,滿足您從永生化細胞到原代和干細胞,從動物體內水平到cGMP細胞治療等不同實驗需求:


      A級慢病毒純化工藝:

      通過超速離心初步濃縮慢病毒顆粒,同時去除病毒上清中的血清蛋白和宿主蛋白,大部分質粒DNA和宿主DNA,然后應用超濾,
      進一步濃縮,去除質粒DNA和宿主DNA,獲得高純度慢病毒產品。







      B級慢病毒純化工藝:

      通過切向流過濾系統,在濃縮慢病毒的同時,極大程度地去除DNA殘留和蛋白殘留,同時通過超濾進一步濃縮和純化,獲得超純
      慢病毒產品。



      C級慢病毒純化工藝:

      通過陰陽離子交換層析,特異性吸附慢病毒顆粒,然后運用鹽離子洗脫,獲得可用于臨床試驗的慢病毒產品。



      質量檢測

      慢病毒質量檢測標準:

      FDA和《中國藥典》中針對病毒疫苗等制劑提出了病毒滴度(≥2E+8TU/ml),質粒殘留(≤4E+8-copy/ml),宿主DNA
      殘留(≤10ng/ml),BSA殘留(≤50ng/ml)等產品質量和安全性的純度要求,同時針對污染和載體安全性,提出了支原體,
      細菌等微生物安全和RCL的要求。吉凱基因根據中國藥典法質量標準,將病毒樣品送至專業檢測機構,嚴格測定每一生產批次慢
      病毒的各項指標。

      檢測項目 檢測方法 檢測結果 單位 參考檢測范圍
      支原體 Nest PCR 陰性 .. 陰性
      內毒素 LAL 合格 EU/mI ≤50
      衣原體 培養法 陰性 .. 陰性
      細菌 培養法 陰性 .. 陰性
      真菌 培養法 陰性 .. 陰性
      活性滴度 絕對定量 1.00E+08 TU/mI ≥1E+8TU

      吉凱病毒質量檢測標準




      慢病毒鑒定方法:

      吉凱基因使用精準的絕對定量qPCR法與GFP熒光計數法檢測活性病毒的感染滴度。這兩種檢測方法直接測定的是插入到細胞基
      因組的病毒基因組拷貝數,最接近真實滴度。而絕對定量qPCR法更是醫療級病毒產品公認的滴度檢測方法,測定滴度更準確,
      杜絕虛假。

      檢測項目 原理 優點 缺點
      GEP熒光計數法 FACS(流式細胞計數) 經典方法,重復性好
      檢測活性病毒的感染滴度
      對儀器和操作要求高
      操作復雜
      絕對定量qPCR法
      (DNA定量法)
      病毒感染工具細胞后,抽提整合目的片段的細胞基因組DNA,與標準品比較 檢測活性病毒的感染滴度
      最接近真實滴度
      對儀器和操作要求高
      操作復雜
      RT-qPCR法
      ( RNA基因組法)
      病毒梯度稀釋感染工具細胞后,抽提RNA,RT-qPCR檢測病毒基因組表達 檢測活性病毒的感染滴度 受限于病毒感染后檢測
      基因的表達豐度
      p24核心蛋白
      ELISA定量法
      利用慢病毒顆粒穩定表達的p24蛋白進行ELISA檢測 簡單,快捷,重復性好 反映的是病毒物理顆粒數不是活性滴度

      市場常見滴度檢測方法比較




      想要了解吉凱基因慢病毒包裝完整流程,請點擊這里下載慢病毒構建包裝報告>>

      載體選擇

      吉凱提供完善的慢病毒產品體系,用于操作編碼基因和非編碼基因,如lncRNA、microRNA、circRNA。以下慢病毒載體可供您選擇,點擊查看載體圖譜>>
      調控方式 載體編號 元件順序 原核抗性 真核抗性 熒光標記
      啟動子
      熒光標記 RNAi/過表達
      啟動子
      過表達 GV365 Ubi-MCS-3FLAG
      -CMV-EGFP
      Ampicillin CMV GFP Ubiquitin
      GV320 Ubi-MCS-3FLAG
      -SV40-Cherry
      Ampicillin SV40 Cherry Ubiquitin
      GV341 Ubi-MCS-3FLAG
      -SV40-puromycin
      Ampicillin Puromycin Ubiquitin
      GV358 Ubi-MCS-
      3FLAG
      -CMV-EGFP
      Ampicillin Puromycin SV40 GFP Ubiquitin
      GV492 Ubi-MCS-3FLAG-
      CBh-gcGFP-IRES
      -puromycin
      Ampicillin Puromycin CBh GFP Ubiquitin
      過表達
      Tet-on
      GV308 TetllP-MCS-3FLAG
      -Ubi-TetR-IRES
      -Puromycin
      Ampicillin Puromycin TtlIP
      干擾 GV112 hU6-MCS
      -CMV-
      Puromycin
      Ampicillin Puromycin U6
      GV115 hU6-MCS-CMV-
      EGFP
      Ampicillin CMV GFP U6
      GV248 hU6-MCS-Ubiquitin
      -EGFP-IRES-
      puromycin
      Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
      GV298 U6-MCS-Ubiquitin
      -Cherry-IRES-
      puromycin
      Ampicillin Puromycin Ubiquitin Cherry U6
      GV493 hU6-MCS-CBh-
      gcGFP-IRES-
      puromycin
      Ampicillin Puromycin CBh GFP U6
      干擾Tet-on GV307 TetlIP-TurboRFP
      -MCS(MIR30)-Ubi-
      TetR-IRES
      -Puromycin
      Ampicillin Puromycin TetlIP RFP TetlIP
      miRNA-up GV369 Ubi-MCS-SV40
      -EGFP-IRES
      -puromycin
      Ampicillin Puromycin SV40 GFP Ubiquitin
      GV209 H1-MCS-CMV
      -EGFP
      Ampicillin CMV GFP H1
      GV309 hU6-MCS-Ubiquitin
      -EGFP-IRES
      -puromycin
      Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
      miRNA-down GV280 hU6-MCS-Ubiquitin
      -EGFP-IRES
      -puromycin
      Ampicillin Puromycin Ubiquitin GFP U6
      GV234 hU6-MCS-CMV
      -EGFP
      Ampicillin CMV GFP U6

      應用案例

      1. 細胞感染

      慢病毒可有效感染神經元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類型的細胞,對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。

      了解慢病毒細胞感染操作及更多細胞推薦MOI 請點擊這里>>




      2. 在體注射

      2.1 神經系統

      代表文獻 吉凱客戶文章Nature medicine,2010.16(12):1439-1443.

      文獻來源:Treatment of cerebral ischemia by disrupting ischemia-induced interaction of nNOS with PSD-95.




      2.2  心血管系統

      代表文獻 Circulation,2016:CIRCULATIONAHA,116.017949.

      文獻來源:Inhibition of aberrant microRNA-133a expression in endothelial cells by statin prevents endothelial dysfunction by targeting GTP cyclohydrolase 1 in vivo.




      2.3  肝臟

      代表文獻 吉凱客戶文章 Joumal fo virology, 2016, 90(4): 1729-1740.

      文獻來源:Hepatitis B virus X protein induces hepatic steatosis by enhancing the expression of liver fatty acid binding protein.




      2.4  肺

      代表文獻 Cell death & disease, 2017, 8(1): e2566.

      文獻來源:MicroRNA-101 inhibits invasion and angiogenesis through targeting ITGA3 and its systemic delivery inhibits lung metastasis in nasopharyngeal carcinoma.




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      引用文獻

      1. The metabolic ER stress sensor IRE1α suppresses alternative activation of macrophages and impairs energy expenditure in obesity. 2017, NATURE IMMUNOLOGY (IF=21.506). 吉凱產品:過表達慢病毒 研究領域:能量代謝  中國科學院上海生命科學研究院營養科學研究所

      2. Cardiac Fibroblast-Specific Activating Transcription Factor 3 Protects Against Heart Failure by Suppressing MAP2K3-p38 Signaling. 2017, Circulation (IF=19.309). 吉凱產品:RNAi慢病毒 研究領域:心臟衰竭  首都醫科大學附屬北京安貞醫院

      3. MicroRNA 301A Promotes Intestinal Inflammation and Colitis-Associated Cancer Development by Inhibiting BTG1. 2017, Gastroenterology (IF=18.392). 吉凱產品microRNA慢病毒 研究領域小腸和結腸炎癥  上海市第十人民醫院

      4. A Critical Role of Presynaptic Cadherin/Catenin/p140Cap Complexes in Stabilizing Spines and Functional Synapses in the Neocortex. 2017, Neuron (IF=14.024). 吉凱產品RNAi慢病毒 研究領域神經  中國科學院神經科學研究所

      5. EphrinB2 Regulates Cardiac Fibrosis Through Modulating the Interaction of Stat3 and TGF-β/Smad3 Signaling. 2017, Circulation Research (IF=13.965). 吉凱產品:RNAi慢病毒和過表達慢病毒  研究領域:心臟纖維化  浙江大學醫學院附屬第二醫院

      6. Aldehyde dehydrogenase-2 (ALDH2) opposes hepatocellular carcinoma progression by regulating AMP-activated protein kinase signaling in mice. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凱產品:過表達慢病毒  研究領域:肝癌  第二軍醫大學
      7. PD‐1 Checkpoint Blockade in Combination with an mTOR Inhibitor Restrains Hepatocellular Carcinoma Growth Induced by Hepatoma Cell‐Intrinsic PD‐1. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凱產品:過表達慢病毒  研究領域:肝癌  復旦大學附屬中山醫院
      8. Distinct role of nuclear receptor corepressor 1 regulated de novo fatty acids synthesis in liver regeneration and hepatocarcinogenesis in mice. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凱產品:RNAi慢病毒  研究領域:肝再生和肝癌  第二軍醫大學
      9. SIRT1/HSF1/HSPs Pathway is Essential for Exenatide-alleviated Lipid-induced Hepatic Endoplasmic Reticulum Stress. 2017, Hepatology (IF=13.246). 吉凱產品:RNAi慢病毒  研究領域:肝臟內質網應激  中山大學附屬第三醫院

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